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利用Split GFP 来筛选表达

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当碰到某个没有做过或者没有可参考文献的蛋白的时候,这时就会有非常多的表达条件需要来筛选去找到最优的表达条件(详情请看质粒设计和表达筛选部分)。传统的表达检测办法是在破菌后跑电泳或者做蛋白质印迹,但这些方法太麻烦而且样品量一大时间就会太过冗长。为了加快筛选的速度和效率,佰翱得已经在我们日常使用的三种表达体系中(大肠杆菌,昆虫细胞和哺乳动物细胞)建立了Split GFP11蛋白的表达和重组的筛选体系 (S.Cabantous et. al. Nature Biotechnology 2004) 。重组蛋白通过一段连接序列将GFP11片段(大约15个氨基酸)连在N端或者C端,当这个GFP11片段与GFP另外的部分(GFP1-10,大约200个氨基酸,既可以共表达也可以在后期直接加入)结合后,就会产生荧光。因此,荧光值的高低水平也能够作为检测折叠正确的可溶性重组蛋白表达量的一个参数。虽然这个体系有时会有假阴性出现,但是能够非常快速的筛选数量可观的表达条件这一优势,使得这种方法还是非常值得一试。

 

佰翱得利用Split GFP11 蛋白筛选表达条件:

 

为了检测蛋白的表达量,我们将大肠杆菌菌液破碎(已经过诱导表达)的上清与包含有GFP1-10片段的检测溶液混合,荧光值(Ex480nm, Em510nm)会随着时间的推移升高。至于昆虫细胞和哺乳动物细胞中的表达检测(转染之后),在去除培养基之后就直接往细胞中加入检测溶液(包含了一种能够融膜的去垢剂)。

 

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