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单颗粒冷冻电镜

单颗粒冷冻电镜

  • 分类:结构生物学
  • 发布时间:2020-08-14 00:00:00
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概要:
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佰翱得专业的冷冻电镜团队
自2017年冷冻电镜被授予诺奖以来,用于解析生物大分子结构的冷冻电镜技术备受关注。冷冻电镜解析成为一种趋势, 并将逐渐比肩并或最终超越晶体衍射技术,在药物研发中发挥巨大作用。从大的蛋白复合体、膜蛋白、动态构象到病毒结构和抗原表位,这些蛋白或难于形成晶体或衍射较差,都可以尝试冷冻电镜获得最终结构。
佰翱得早在2012年,就拥有当时最完善的室内晶体衍射平台。为适应全球结构解析需求,2018年,我们采购了一台200kv的TF20冷冻电镜,大大提高了样品优化的效率。 在2020年,为进一步整合上下游能力加速研发,我们采购了最新一代的300kv的冷冻电子显微镜,至此我们平台的冷冻电镜数量达到4台,这一突破性的硬件升级和积攒的人才,客户优势,使我们成为国内最早,也是唯一一家,具有全流程,从基因到结构解析的商业化企业。
 
什么是单颗粒冷冻电镜技术?
单颗粒冷冻电镜技术正逐渐替代传统的晶体学,成为解析大分子蛋白,复合物和分子机器的常规方法,它以超高分辨率来确定生物大分子近原子分辨率的结构,在最小分辨力和分子量,靶点复杂程度上,不断刷新记录。这种方法常规流程为:蛋白溶液在低温下被玻璃化,并置入样品室,在高压电子束照射下成像。通常情况下,需要从显微照片中提取出成千上万(甚至上百万)单颗粒的2D图像,然后根据每个单颗粒的取向将他们“合并”最后得到生物大分子的高分辨率3D结构模型。
 
为什么选择单颗粒冷冻电镜技术?
SPA可以常规地完成近原子分辨率的蛋白质大分子的结构测定,与x射线晶体学等其他测定大分子结构的方法相比,单颗粒冷冻电镜技术有许多独特的优点:
1.样品制备的过程不需要结晶,这对膜蛋白等难以结晶的蛋白非常有用。
2.样品在接近天然的水溶状态下被解析,结构更加真实。
3.实验只需少量(微克级)样品,这对低产量样品有很大帮助。
4.能检测不同功能状态的大分子结构,并能在一个条件下得到不同的构象状态。
5.可以检测大型蛋白质复合物的结构,即使他们有组成和构象的异质性。
 
为什么选择佰翱得的单颗粒冷冻电镜服务?
1.佰翱得拥有单颗粒冷冻电镜科学家团队,他们具有很强的学术和行业经验。
2.佰翱得拥有包括Titan Krios在内的全套高端冷冻电镜设备,提供从基因合成到冷冻电镜结构的一站式服务。
3.佰翱得配备蛋白质生产和纯化团队,这对样品制备和冷冻制样过程的快速优化至关重要。
 
佰翱得单颗粒冷冻电镜服务流程:从样品到结构

· 1.样品制备:
样品制备是整个工作流程中最重要的一步。我们希望蛋白是在佰翱得生产和纯化的,因为新鲜的样品能大大提高单颗粒冷冻电镜数据采集的成功率。佰翱得蛋白质平台与冷冻电镜平台之间的交互反馈保证了样品的快速优化。
· 2.负染检测:
负染确定样品均一性。我们还可以进行二维分类和三维重构来进一步评估样品颗粒的状态。
· 3.冷冻制样:
冷冻制样是将样品溶液转化为玻璃态的过程,蛋白质颗粒被速冻并捕获到其接近生理的状态。不同的pH值、缓冲液、网格、冷冻制样条件以及添加剂将被优化,以获得最佳的冷冻制样结果。
· 4.高分辨率数据采集:
高分辨率的数据采集将由经验丰富的操作人员在世界领先的高端Titan Krios显微镜上进行。佰翱得可以保证即时且充足的冷冻电镜机时,没有任何延迟。
· 5.数据处理与三维重构:
数据处理与三维重构主要包括位移校正、CTF估计、颗粒挑选、二维分类、三维分类、三维结构优化以及多个校正步骤。最终的3D密度图提供了接近原子分辨率的结构,可以显示氨基酸的侧链和结合的小分子化合物。客户通常对化合物结合区域的详细结构感兴趣,由于构象的异质性或灵活性,化合物结合区的分辨率可能不是最好的。但我们可以对该区域进行颗粒间的聚焦分类和局部优化,使局部结果得到增强,从而清晰地显示出小分子的密度。    
· 6.模型建立:
近原子分辨率密度图允许从头建模,这将更加直观的揭示蛋白质-蛋白质或蛋白质-化合物相互作用的细节。

 

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