佰翱得成功解析最大离子通道RyR1的冷冻电镜结构
发布时间:
2023-02-17 14:24
近日，佰翱得团队解析了兔源全长RyR1的冷冻电镜结构至2.8Å，展示了目前已知最大离子通道兰尼碱受体RyR1的近原子分辨率三维结构，为理解其功能提供了更清晰的线索。
钙离子是生命体中最为丰富的阳离子之一，也是细胞信号传导中重要的第二信使，参与调控肌肉收缩、细胞分泌、神经信号传递等重要生命过程。在肌肉细胞中，当肌质网中的钙离子释放到细胞质时，会引发肌肉的收缩反应。这一过程称为肌肉兴奋收缩偶联，而负责将钙离子从肌质网快速大量释放到胞浆中的是一种称作兰尼碱受体（Ryanodine receptor, RyR）的高通量钙离子通道[1]。
RyR以四聚体的形式行使功能，每个单体约5000个氨基酸，因此四聚体总分子量达到二百三十万道尔顿（2.3 MDa），是目前已知的最大离子通道蛋白。在哺乳动物中有三种RyR蛋白，其中RyR1主要分布在骨骼肌细胞中，RyR2主要分布在心肌细胞中，RyR3则最早在大脑细胞中发现，这三种RyR共享70%的序列。RyR离子通道的开闭直接或间接的受到多种蛋白（如DHPR, FKBP12.6, calmodulin, 磷酸酶，各种激酶等）和离子浓度(如Ca2+，Mg2+)等多种信号的复杂调控。大量文献报道统计表明，目前已有超过500种RyR突变体与疾病有关。这类受体不仅与骨骼肌疾病，心肌疾病有关，而且与哮喘等多种疾病存在关联，因此备受科学家们的关注[2]。
自上世纪70年代开始，国内外很多实验室都致力RyR的结构分析，但限于RyR庞大的分子量，蛋白获取和蛋白结晶的难度都非常大。早中期仅有个别小片段（非全长）的晶体结构。随着冷冻电镜技术兴起，过去20年中，多篇文献共报道了70余个RyR的电镜结构，其中整体分辨率高于4Å的仅有10余个结构，高于3Å的仅有1个结构[3]。不同于已发表的大多数文献中的样品制备方法，佰翱得团队采用了新的蛋白纯化策略[4]，从兔子肌肉中直接提取获得了高纯度（>95%）、高浓度（>5 mg/ml）和高均一性的蛋白样品，并依托于佰翱得世界领先的商用冷冻电镜平台，一举成功解析了RyR1蛋白三维结构至近原子分辨率，整个周期不到2周。该离子通道呈关闭状态，总体分辨率达到了2.8Å，其中负责离子运输的跨膜区分辨率甚至达到2.5 Å，侧链密度清晰可见，可以准确搭建原子结构模型。
RyR1的结构整体呈现四次对称的蘑菇形状。其跨膜区具有类似于电压门控离子通道的折叠特点，但还有额外的结构域以实现对通道开闭状态的调控。跨膜区的高分辨率及高质量密度更清晰的揭示了RyR1识别钙离子的机理及其高通量运输钙离子的分子基础。佰翱得团队内部对于该RyR1整体结构分析显示了庞大的细胞质结构域的层级结构组织特征以及调控通道开关的可能机制。该内部研究项目对于肌肉-收缩偶联以及与之相关的疾病的更深层的认识也具有重要的意义，也为治疗相关疾病提供了更清晰的重要的结构线索。
佰翱得致力于为全球创新药物研发机构提供优质的CRO服务，并建设有当前全球领先的商业冷冻电镜创新中心，以膜蛋白研究为核心的药靶蛋白创新中心和“佰翱得蛋白”品牌，期望能依托自身强大的药物早期开发平台，在每个靶点上都能够提供蛋白-分析-筛选-结构的早期研发工具包，为客户提供全方位的解决方案。
[1] Iyer, Kavita A., Yifan Hu, Ashok R. Nayak, Nagomi Kurebayashi, Takashi Murayama, and Montserrat Samsó. "Structural mechanism of two gain-of-function cardiac and skeletal RyR mutations at an equivalent site by cryo-EM." Science advances 6, no. 31 (2020): eabb2964.
[2] Iyer, Kavita A., Yifan Hu, Thomas Klose, Takashi Murayama, and Montserrat Samsó. "Molecular mechanism of the severe MH/CCD mutation Y522S in skeletal ryanodine receptor (RyR1) by cryo-EM." Proceedings of the National Academy of Sciences 119, no. 30 (2022): e2122140119.
[3] EMDB maps ryr1. URL https://www.emdataresource.org/emdlist=ryr1 [Online; last accessed January 2023].
[4] Hu, Yifan, Kavita A. Iyer, Ashok R. Nayak, Nagomi Kurebayashi, Takashi Murayama, and Montserrat Samsó. "Purification of recombinant wild type and mutant ryanodine receptors expressed in HEK293 cells." Bio-protocol 11, no. 15 (2021): e4112-e4112.